本文標題："使用基因槍轉植基因注意事項有哪些？"

使用基因槍轉植基因

注意事項：

1.     切勿將槍口對人.

2.     事前備妥polyvinylpyrollidone(MW＝360,000,100g約750元), Spermidine(Sigma #S-0266, 5g約3,500元). 99.9﹪酒精. 15ml與1.5ml離心管, 0.05M Spermidine, 1M CaCl2, 20mg/ml polyvinylpyrollidone (溶于酒精) 使用前取少量稀釋成0.1mg/ml, 準備3.5ml以供50發子彈用,

3.     每50發子彈,  用35mg金粉  (直接置入離心管測),  100μg DNA (濃度＞1μg/μl). 管子長76cm. 以3.5ml液狀充填.

4.     子彈準備架左方有2個小膠圈(O-rings), 及槍噴口有1個小膠圈, 用久磨損須更換.

步    驟：  (每50發子彈用)

1.     將35mg金粉(直接置入1.5ml離心管測), 加入100μl之0.05M Spermidine, vortex 5sec, sonicate 10sec.

2.     加入100μg DNA(若同時轉植1種以上基因, 等量加入), vortex 5sec.

3.     加入100μl 1M之CaCl2, 以低速vortex 5sec, 再置室溫使沉淀10min, 離心4,000rpm, 15sec, 吸除上清,

4.     加入1ml 99.9﹪酒精, 以低速vortex 5sec, 離心4,000rpm, 15sec, 吸除上清, 如此, 重覆3次, 吸除上清.

5.     加入0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 0.5ml, 以低速vortex 5sec, 將管內物全部吸入15ml離心管中, 再以0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml加入原1.5ml離心管中, 再以低速vortex 5sec, 將管內物再全部吸入15ml離心管中, 再以0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml 加入原1.5ml離心管中, 再以低速vortex 5sec, 將管內物再全部吸入15ml離心管中, 再于15ml離心管中加入0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml, 再以低速vortex此15ml離心管5sec, 此時可將此管保存于-20℃. 或接下列步驟.

6.     將子彈準備架安置好, 并通入N2, 將76cm子彈管由右側插入, 直通至左側環內1cm, 將氮氣開關調至0.3~0.4, 并吹氣入管15min.

7.     關掉氮氣開關, 將管取出, 將一端插入接有軟接頭的10ml針筒管, 將子彈管另一端置入含3.5ml黃金粉, DNA的液體中(此液體需先以低速vortex 10sec, 兩sonicate 30sec, 并立即使用), 以針筒吸取液體至子彈管長64cm處, 將子彈管取出, 但是再以針筒吸子彈管中液體, 使子彈管兩端均留下約6cm空白, 立即將子彈管插入準備架, 并等5min, 使金粉粘在管壁, 再以針筒以2cm/sec的速度將子彈管中酒精吸除.

8.     取下針筒, 將準備架旋轉開關打開, 使轉動30sec, 再打開氮氣, 使子彈管乾燥5min, 關氮氣, 停轉, 將子彈管取出.

9.     檢查子彈管, 看金粉是否均勻分佈, 將不良部份以簽字筆注記, 以便切成子彈時棄之.

10.將子彈保存盒(含乾燥劑)置切子彈器下, 將子彈管插入切子彈器, 開始切子彈, 完成后將子彈保存盒標示清楚, 蓋好, 并以parafilm封好, 保存于4℃. 在使用前將子彈裝入彈夾, 將彈夾以"12"向上裝至定位.

11.將氦氣接好, 調至400psi, 最大至600psi, 準備射擊. 射擊后, 取下彈夾, 關氦氣總開關, 將氦氣調節閥逆時針轉, 排氣, 再拆下接管.

12.若射擊動物附著細胞, 吸除培養液后為之, 浮懸細胞則以5×107cells/ml濃度, 取20μl, 滴于培養皿上, 使分佈直徑小于1.5cm, 若射擊動物皮層, 先剃去毛, 用70﹪酒精消毒后為之.

若要以RNA取代DNA, 則不用CaCl2, 與polyvinylpyrollidone而用5M ammonium與2-propanol來將RNA附在金粉上. 其步驟類同處理DNA.

簡述如下：

1.     量35mg金粉, 加入液體mRNA, (5μgRNA/mg金粉), 加入液體mRNA體管1/10量的5M ammonium與2倍量的2-propanol, vortex 15sec, 離心離心4,000rpm, 15sec, 吸除上清.

2.     加入1ml 99.9﹪酒精, 以低速vortex 5sec, 離心4,000rpm, 15sec, 吸除上清.

3.     加入0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 0.5ml, 以低速vortex 5sec, 將管內物全部吸入15ml離心管中, 再以0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml 加入原1.5ml離心管中, 再以低速vortex 5sec.

4.     將管內物再全部吸入15ml離心管中, 再以0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml加入原1.5ml離心管中, 再以低速vortex 5sec.

5.     將管內物再全部吸入15ml離心管中, 再于15ml離心管中加入0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml, 再以低速vortex 此15ml離心管5sec, 此時可將此管保存于-20℃. 即成.